DRA MUY BUENAS TARDES SOBRE EL TEMA DE INVESTIGACION DEL ENTEROCOCO RESISTENTE A LA VANCOMICINA
GLUCOPÉPTIDOS EN Enterococcus La resistencia a la vancomicina fue inicialmente descrita en cepas de la especie E. faecium aisladas en Francia y Reino Unido. La epidemiología de los enterococos resistentes a la vancomicina (EVR) parece ser diferente en América y en Europa.Actualmente, menos de un 5% del total de enterococos aislados en Europa son resistentes a la vancomicina. La mayoría corresponden a aislamientos procedentes de casos de colonización o infección adquiridos en la comunidad, aunque existen descritos brotes intrahospitalarios. Algunos autores han apoyado la hipótesis de que la aparición de estas cepas estaría relacionada con la utilización del glucopéptido avoparcina en la agricultura y la industria alimentaria, ya que se han aislado en animales de granja. En los Estados Unidos no está autorizada la utilización de este glucopéptido con este fin, y no se han aislado ERV en los animales de granja. Entre los factores de riesgo de la infección por ERV, hay muchos comunes a la infección por enterococos sensibles a la vancomicina: a) la administración de antibióticos múltiples o de amplio espectro (vancomicina, cefalosporinas, carbapenemas y antibióticos con acción antianaeróbica, como la clindamicina y el metronidazol), que favorecerían el sobrecrecimiento de los enterococos al actuar sobre el resto de la flora bacteriana, b) pacientes con enfermedad de base grave: transplante, cáncer, diabetes mellitus, etc., c) la hospitalización en una unidad quirúrgica, onco-hematológica o de cuidados intensivos, d) una prolongada estancia hospitalaria, e) la yatrogenia no invasiva, como la inmunosupresión, o invasiva, como la cateterización, y f) la proximidad a pacientes colonizados o infectados por ERV.
FENOTIPOS DE LA VANCOMICINA Fenotipo VanD Este fenotipo de resistencia se ha descrito en una cepa de E. faecium aislada en los Estados Unidos. Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina (CMI 64 μg/ml) y de bajo nivel a la teicoplanina (CMI 4 μg/ml). En esteaislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina
Fenotipo de resistencia VanC
El fenotipo VanC se observa en las especies Enterococcus gallinarum Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens intrínsecamente resistentes a la vancomicina, con CIM entre 2-32 μg/ml pero sensibles a la teicoplanina. El gen vanC1,presente en la especie E. gallinarum,y el vanC2,presente en las especies E. casseliflavus yE. flavescens(porhomología del ADN parece tratarse de la misma especie), determinan la síntesis del depsipéptido terminal D-alaninaDserina quetambién tiene menor afinidad por la vancomicina
Fenotipo de resistencia VanB Las cepas portadoras del gen vanB se caracterizan por niveles variables de resistencia a la vancomicina (CIM entre 4 y ≥1000 μg/ml) y sensibilidad a la teicoplanina. En estos casos, a diferencia de las cepas VanA, la resistencia estaría inducida por lavancomicina pero no por la teicoplanina, a pesar de que se han descrito mutantes resistentes a la teicoplanina in vivo,tras tratamiento con vancomicina, y en animales de experimentación tratados con teicoplanina
Fenotipo VanA
Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥64 μg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥16 μg/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. El gen de resistencia vanA se encuentra Localizado en el trasposón Tn1546 de 10,8 Kb, generalmente localizado en un plásmido, aunque, en algunos casos, se ha transferido al cromosoma. En este trasposón están codificadas las siete proteínas que intervienen en la resistencia a los glucopéptidos, a saber: a) VanR y VanS, implicadas en la regulación del gen de resistencia; b) VanA, VanH y VanX, que serían las responsables directas de la resistencia a glucopéptidos; c) VanY y VanZ, proteínas accesorias. La vancomicina actúa uniéndose al dipéptido D-alanil-D-alanina terminal del precusor del péptidoglucano, inhibiendo la síntesis de la pared celular. La proteína VanA es una ligasa similar a las codificadas cromosómicamente pero que, en lugar de sintetizar el dipéptido terminal D-Ala-D-Ala, sintetiza el depsipéptido D-Ala-D-lactato con mucha menor afinidad por la vancomicina. La proteína VanH reduciría el piruvato a D-Lac, necesario para la expresión de la proteína VanA, pero que está generalmente ausente en el ambiente natural de los enterococos
El gen MecA, es responsable de la resistencia a la meticilina en S. aureus ,(S. aureus resistente a la meticilina) (SARM), no es endógeno y se encuentra integrado al cromosoma bacterianoEste gen se encuentra dentro de un elemento cromosomal móvil heterogéneo conocido como " Staphylococcal cassette chromosome mec " (SSCmec) . Los aislamientos que poseen este elemento genético presentan una disminución en la afinidad a meticilina
¿cual es gen que hace que el enterococo se haga resistente a la vancomicina?
En 1986, se aíslan las primeras cepas de Enterococcus resistentes a los glucopéptidos. En la actualidad, este tipo de resistencia se asocia a tres fenotipos bien definidos: VanA, VanB y VanC . Últimamente, se ha descrito un cuarto tipo, VanD, en una cepa de E. faecium.
Fenotipo VanA Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina como a la teicoplanina . La resistencia tipo VanA es transferible.
Fenotipo de resistencia VanB Las cepas portadoras del gen vanB se caracterizan por niveles variables de resistencia a la vancomicina y sensibilidad a la teicoplanina.
Fenotipo de resistencia VanC El fenotipo VanC se observa en las especies Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens, intrínsecamente resistentes a la vancomicina, pero sensibles a la teicoplanina.
Fenotipo VanD Este fenotipo de resistencia se ha descrito en una cepa de E. faecium aislada en los Estados Unidos. Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina y de bajo nivel a la teicoplanina . En este aislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina descritos hasta la actualidad.
RESISTENCIA DEL ENTEROCOCO A LA VANCOMICINA: La resistencia a la vancomicina fue inicialmente descrita en cepas de la especie de Enterococo faecium aisladas en Francia y Reino Unido. La epidemiología de los enterococos resistentes a la vancomicina (EVR) parece ser diferente en América y en Europa. Actualmente, menos de un 5% del total de enterococos aislados en Europa son resistentes a la vancomicina. La mayoría corresponden a aislamientos procedentes de casos de colonización o infección adquiridos en la comunidad, aunque existen descritos brotes intrahospitalarios. Algunos autores han apoyado la hipótesis de que la aparición de estas cepas estaría relacionada con la utilización del glucopéptido avoparcina en la agricultura y la industria alimentaria, ya que se han aislado en animales de granja. En los Estados Unidos no está autorizada la utilización de este glucopéptido con este fin, y no se han aislado ERV en los animales de granja. Entre los factores de riesgo de la infección por ERV, hay muchos comunes a la infección por enterococos sensibles a la vancomicina: a) La administración de antibióticos múltiples o de amplio espectro (vancomicina, cefalosporinas, carbapenemas y antibióticos con acción antianaeróbica, como la clindamicina y el metronidazol), que favorecerían el sobrecrecimiento de los enterococos al actuar sobre el resto de la flora bacteriana. b) Pacientes con enfermedad de base grave: transplante, cáncer, diabetes mellitus, etc. c) La hospitalización en una unidad quirúrgica, onco-hematológica o de cuidados intensivos. d) Una prolongada estancia hospitalaria. e) La yatrogenia no invasiva, como la inmunosupresión, o invasiva, como la cateterización. f) La proximidad a pacientes colonizados o infectados por ERV.
GEN MECA Cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina y muchos otros antibióticos son las causas principales de las infecciones nosocomiales en todo el mundo. Resistencia a la meticilina es determinada por el gen mecA, que codifica la baja afinidad penicilina vinculante proteínas PBP 2A. El gen mecA forma parte de un cromosoma estafilococia 21 - 60 kb cassette mec (SCCmec), un elemento genético móvil que también puede contener estructuras genéticas tales como Tn554, pUB110 y pT181 que codifican resistencia a los antibióticos no-β-lactámicos. Se han planteado dos hipótesis para explicar el origen evolutivo de resistente a la meticilina cepas de S. aureus (MRSA). La hipótesis solo clon, basada en el análisis tempranos de los polimorfismos de longitud de fragmento restricción obtenidos para SARM aislados recogidos en todo el mundo mediante el uso de sondas para la mecA y Tn554, sugiere que mecA entró en la población de S. aureus en una ocasión y dio lugar a la formación de un solo clon MRSA que desde entonces se ha extendido por todo el mundo. La segunda hipótesis, basada en la detección de la mecA en tipos diversos de S. aureus enzimática multilocus electroforesis, propone que las cepas MRSA evolucionaron varias veces por medio de la transferencia horizontal de mecA en cepas distintas filogenéticamente meticilina-susceptibles S. aureus (MSSA) precursor. Mediante el uso de tecnología de microarrays de ADN, mecA se ha detectado en al menos cinco linajes divergentes, lo que implica que la transferencia horizontal de la mecA ha jugado un papel fundamental en la evolución de MRSA. La transferencia de mecA de S. epidermidis a S. aureus recientemente fue presenciada en vivo, sugiriendo que mecA puede transferir más con frecuencia a MSSA.
EL gen mecA El gen mecA es un gen que se encuentra en bacterianas células. El mecA gen permite una bacteria sea resistente a antibióticos tales como la meticilina , penicilina y otros antibióticos penicilina similares. El soporte más comúnmente conocido del mecA es la bacteria conocida como MRSA . También se encuentra en Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae cepas resistentes a los antibióticos penicilina similares. El mecA gen no permite que la estructura de anillo de los antibióticos penicilina como para atacar las enzimas que ayudan a formar la pared celular de la bacteria (transpeptidasas), y por lo tanto las bacterias se le permite replicar de forma normal. El gen codifica la proteína PBP2a ( proteína de unión a penicilina 2A). PBP2a tiene una baja afinidad por los antibióticos beta-lactámicos, tales como la meticilina y penicilina . Esto permite transpeptidasa actividad en presencia de beta-lactámicos, evitando que la inhibición de la síntesis de la pared celular.
FENOTIPOS DE RESISTENCIA A LA VANCOMICINA Fenotipo VanA Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥64 μg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥16 μg/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. El gen de resistencia vanA se encuentra localizado en el trasposón Tn 1546 de 10,8 Kb, generalmente localizado en un plásmido, aunque, en algunos casos, se ha transferido al cromosoma. En este trasposón están codificadas las siete proteínas que intervienen en la resistencia a los glucopéptidos, a saber: a) VanR y VanS, implicadas en la regulación del gen de resistencia; b) VanA, VanH y VanX, que serían las responsables directas de la resistencia a glucopéptidos; c) VanY y VanZ, proteínas accesorias. La expresión de la resistencia a la vancomicina dependerá del desequilibrio entre los precursores con el depsipéptido o el dipéptido terminal. La proteína VanX es una peptidasa que hidrolizaría el dipéptido D-Ala-D-Ala, pero no el D-Ala-D-Lac, evitando así la síntesis de precursores con afinidad normal a la vancomicina. La proteína VanY hidrolizaría los d-Ala-D-Ala terminales ya incorporados a los precursores del péptidoglucano. La proteína VanZ confiere resistencia de bajo nivel a la teicoplanina por un mecanismo desconocido. Fenotipo Rsistencia VanB La resistencia VanB se transfiere en algunas cepas por conjugación y se asocia a la movilización de material genético de elevado peso molecular de cromosoma a cromosoma. El análisis de la secuencia de aminoácidos de VanB ha permitido demostrar la elevada homología (65-75%) existente con la ligasa VanA, la deshidrogenasa VanH y la dipeptidasa VanX. Probablemente, las diferencias observadas en la expresión fenotípica y en las sustancias inductoras de la resistencia entre las cepas con fenotipo VanA y VanB sean debidas a variaciones en el sistema regulador, cuya homología es menor (<40%) Fenotipo Rsistencia Vanc El gen vanC1,presente en la especie E. gallinarum,y el vanC2 ,presente en las especies E. casseliflavus y E. flavescens (por homología del ADN parece tratarse de la misma especie), determinan la síntesis del depsipéptido terminal D-alanina-D-serina que también tiene menor afinidad por la vancomicina Fenotipo VanD Este fenotipo de resistencia se ha descrito en una cepa de E. faecium aislada en los Estados Unidos. Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina (CMI 64 μg/ml) y de bajo nivel a la teicoplanina (CMI 4 μg/ml). En este aislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina descritos hasta la actualidad
FENOTIPOS DE RESISTENCIA A LA VANCOMICINA Fenotipo VanA Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥ 64 µg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥ 16 µ g/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. El gen de resistencia vanA se encuentra localizado en el trasposón Tn1546, de 10,8 Kb, generalmente localizado en un plásmido, aunque, en algunos casos, se ha transferido al cromosoma. En este trasposón están codificadas las siete proteínas que intervienen en la resistencia a los glucopéptidos, a saber: a) VanR y VanS, implicadas en la regulación del gen de resistencia; b) VanA, VanH y VanX, que serían las responsables directas de la resistencia a glucopéptidos; c) VanY y VanZ, proteínas accesorias. La vancomicina actúa uniéndose al dipéptido D-alanil-D-alanina terminal del precusor del péptidoglucano, inhibiendo la síntesis de la pared celular. La proteína VanA es una ligasa similar a las codificadas cromosómicamente pero que, en lugar de sintetizar el dipéptido terminal D-Ala-D-Ala, sintetiza el depsipéptido D-Ala-D-lactato con mucha menor afinidad por la vancomicina. La proteína VanH reduciría el piruvato a D-Lac, necesario para la expresión de la proteína VanA, pero que está generalmente ausente en el ambiente natural de los enterococos.
GEN MECA El gen mecA se encuentra en un elemento genético móvil conocido como el casete cromosómico (Staphylococcal chromosome cassettemec, SCCmec),que se inserta en un sitio específico del cromosoma bacteriano (attB SCC), cerca del origen de replicación de S. aureus. Esta característica es de gran relevancia porque le permite replicarse en forma temprana y transcribir los genes de resistencia importados. Dada la complejidad de este mecanismo de resistencia, se ha considerado poco probable que haya surgido por la presión selectiva ejercida por la introducción de los medicamentos β- lactámicos. Aún no está claro el origen del gen mecApero se ha propuesto que pudo haber evolucionado mucho tiempo atrás, en especies de estafilococo libres de penicilinasas que se encontraban bajo presión selectiva por la penicilina, cuando se inició su utilización intensiva como medida profiláctica en veterinaria, luego de su introducción para uso en humanos.
GEN MECA La Cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina y muchos otros antibióticos son las causas principales de las infecciones nosocomiales en todo el mundo. Resistencia a la meticilina es determinada por el gen mecA, que codifica la baja afinidad penicilina vinculante proteínas PBP 2A. El gen mecA forma parte de un cromosoma estafilococia 21 - 60 kb cassette mec (SCCmec), un elemento genético móvil que también puede contener estructuras genéticas tales como Tn554, pUB110 y pT181 que codifican resistencia a los antibióticos no-β-lactámicos. Se han planteado dos hipótesis para explicar el origen evolutivo de resistente a la meticilina cepas de S. aureus (MRSA). La hipótesis solo clon, basada en el análisis tempranos de los polimorfismos de longitud de fragmento restricción obtenidos para SARM aislados recogidos en todo el mundo mediante el uso de sondas para la mecA y Tn554, sugiere que mecA entró en la población de S. aureus en una ocasión y dio lugar a la formación de un solo clon MRSA que desde entonces se ha extendido por todo el mundo. La segunda hipótesis, basada en la detección de la mecA en tipos diversos de S. aureus enzimática multilocus electroforesis, propone que las cepas MRSA evolucionaron varias veces por medio de la transferencia horizontal de mecA en cepas distintas filogenéticamente meticilina-susceptibles S. aureus (MSSA) precursor. Mediante el uso de tecnología de microarrays de ADN, mecA se ha detectado en al menos cinco linajes divergentes, lo que implica que la transferencia horizontal de la mecA ha jugado un papel fundamental en la evolución de MRSA. La transferencia de mecA de S. epidermidis a S. aureus recientemente fue presenciada en vivo,
RESISTENCIA DEL ENTEROCOCO A LA VANCOMICINA:. La epidemiología de los enterococos resistentes a la vancomicina (EVR) parece ser diferente en América y en Europa. Actualmente, menos de un 5% del total de enterococos aislados en Europa son resistentes a la vancomicina. La mayoría corresponden a aislamientos procedentes de casos de colonización o infección adquiridos en la comunidad, aunque existen descritos brotes intrahospitalarios. Algunos autores han apoyado la hipótesis de que la aparición de estas cepas estaría relacionada con la utilización del glucopéptido avoparcina en la agricultura y la industria alimentaria, ya que se han aislado en animales de granja. En los Estados Unidos no está autorizada la utilización de este glucopéptido con este fin, y no se han aislado ERV en los animales de granja. Entre los factores de riesgo de la infección por ERV, hay muchos comunes a la infección por enterococos sensibles a la vancomicina: a) La administración de antibióticos múltiples o de amplio espectro (vancomicina, cefalosporinas, carbapenemas y antibióticos con acción antianaeróbica, como la clindamicina y el metronidazol), que favorecerían el sobrecrecimiento de los enterococos al actuar sobre el resto de la flora bacteriana. b) Pacientes con enfermedad de base grave: transplante, cáncer, diabetes mellitus, etc. c) La hospitalización en una unidad quirúrgica, onco-hematológica o de cuidados intensivos. d) Una prolongada estancia hospitalaria. e) La yatrogenia no invasiva, como la inmunosupresión, o invasiva, como la cateterización. f) La proximidad a pacientes colonizados o infectados por ERV.
FENOTIPOS DE RESISTENCIA A LA VANCOMICINA FENOTIPO RESISTENCIA VAN A Las cepas con fenotipo VanA presenta resistencia de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥64 μg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥16 μg/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. FENOTIPO RESISTENCIA VAN B Se transfiere en algunas cepas por conjugación y se asocia a la movilización de material genético de elevado peso molecular de cromosoma a cromosoma. El análisis de la secuencia de aminoácidos de VanB ha permitido demostrar la elevada homología (65-75%) existente con la ligasa VanA, la deshidrogenasa VanH y la dipeptidasa VanX. Probablemente, las diferencias observadas en la expresión fenotípica y en las sustancias inductoras de la resistencia entre las cepas con fenotipo VanA y VanB sean debidas a variaciones en el sistema regulador, cuya homología es menor (<40%) FENOTIPO RSISTENCIA VANC El gen vanC1,presente en la especie E. gallinarum,y el vanC2 ,presente en las especies E. casseliflavus y E. flavescens (por homología del ADN parece tratarse de la misma especie), determinan la síntesis del depsipéptido terminal D-alanina-D-serina que también tiene menor afinidad por la vancomicina FENOTIPO RESISTENCIA VAN D Se ha descrito en una cepa de E. faecium . Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina (CMI 64 μg/ml) y de bajo nivel a la teicoplanina (CMI 4 μg/ml). En este aislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina descritos hasta la actualidad
Que es el gen mecA? El gen mecA es un gen que se encuentra en células bacterianas. El gen mecA permite que una bacteria se haga resistente a antibióticos , tales como la meticilina , penicilina y otros antibióticos penicilina similares. El soporte más comúnmente conocida del gen mecA es la bacteria conocida como MRSA . También se encuentra en Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae cepas resistentes a los antibióticos penicilina similares. En Staphylococcus especies, mecA se extiende sobre el SCC mec elemento genético. El gen mecA no permite la estructura de anillo de los antibióticos penicilina como para atacar las enzimas que ayudan a formar la pared celular de la bacteria (transpeptidases), y por lo tanto las bacterias se le permite replicar de forma normal. El gen codifica la proteína PBP2a ( proteína de unión a penicilina 2A). PBP2a tiene una baja afinidad por los antibióticos beta-lactámicos, tales como la meticilina y penicilina . Esto permite transpeptidasa actividad en presencia de beta-lactámicos, evitando la inhibición de la síntesis de la pared celular. Gen que hace que hace que el enterococo sea resistente a la vancomicina La resistencia puede tener varios fenotipos: • fenotipo vanA, que normalmente tienen codificados los genes para van A pero presenta modificaciones de otros genes. Tiene resistencia tanto a vancomicina como a teicoplanina. • fenotipo vanB, hay varios genes descritos, con susceptibilidad a teicoplanina y resistencia a vancomicina. • fenotipos vanC, intrínseco de algunas especies como E. gallinarum y E casseliflavus, también con resistencia a vancomicina pero buena susceptibilidad a teicoplanina. Estas especies pueden colonizar el tracto gastrointestinal pero no tienen importancia clínica (en caso encontrarse E. faecalis o E. faecium el paciente debiera ser aislado por un elevado riesgo de diseminación).
ELISA DIRECTO. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. • Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA INDIRECTO. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. • Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA SÁNDWICH “DAS” (DOUBLE ANTIBODY SANDWICH). Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. • Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. • Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
DRA MUY BUENAS TARDES SOBRE EL TEMA DE INVESTIGACION DEL ENTEROCOCO RESISTENTE A LA VANCOMICINA
ResponderEliminarGLUCOPÉPTIDOS EN
Enterococcus
La resistencia a la vancomicina fue inicialmente descrita en cepas de la especie
E. faecium aisladas en Francia y Reino Unido.
La epidemiología de los enterococos resistentes a la vancomicina (EVR) parece ser diferente en América y en Europa.Actualmente, menos de un 5% del total de enterococos aislados en Europa son resistentes a la vancomicina. La mayoría
corresponden a aislamientos procedentes de casos de colonización o infección adquiridos en la comunidad, aunque existen descritos brotes intrahospitalarios. Algunos autores han apoyado la hipótesis de que la aparición de estas cepas estaría relacionada con la utilización del glucopéptido avoparcina en la agricultura y la industria alimentaria, ya que se han aislado en animales de granja. En los Estados Unidos no está autorizada la utilización de este glucopéptido con este fin, y no se han aislado ERV en los animales de granja. Entre los factores de riesgo de la infección por ERV, hay muchos comunes a la infección por enterococos sensibles a la vancomicina: a) la administración de antibióticos múltiples o de amplio espectro (vancomicina, cefalosporinas, carbapenemas y antibióticos con acción antianaeróbica, como la clindamicina y el metronidazol), que favorecerían el sobrecrecimiento de los enterococos al actuar sobre el resto de la flora bacteriana, b) pacientes con enfermedad de base grave: transplante, cáncer, diabetes mellitus, etc., c) la hospitalización en una unidad quirúrgica, onco-hematológica o de cuidados intensivos, d) una prolongada estancia hospitalaria, e) la yatrogenia no invasiva, como la inmunosupresión, o invasiva, como la cateterización, y f) la proximidad a pacientes colonizados o infectados por ERV.
FENOTIPOS DE LA VANCOMICINA
ResponderEliminarFenotipo VanD
Este fenotipo de resistencia se ha descrito en una cepa de E. faecium aislada en los Estados Unidos. Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina (CMI 64 μg/ml) y de bajo nivel a la teicoplanina (CMI 4 μg/ml). En esteaislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina
Fenotipo de resistencia VanC
El fenotipo VanC se observa en las especies Enterococcus gallinarum Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens intrínsecamente resistentes a la vancomicina, con CIM entre 2-32 μg/ml pero sensibles a la teicoplanina.
El gen vanC1,presente en la especie E. gallinarum,y el vanC2,presente en las especies E. casseliflavus yE. flavescens(porhomología del ADN parece tratarse de la misma especie), determinan la síntesis del depsipéptido terminal D-alaninaDserina quetambién tiene menor afinidad por la vancomicina
Fenotipo de resistencia VanB
ResponderEliminarLas cepas portadoras del gen vanB se caracterizan por niveles variables de resistencia a la vancomicina (CIM entre 4 y ≥1000
μg/ml) y sensibilidad a la teicoplanina. En estos casos, a diferencia de las cepas VanA, la resistencia estaría inducida por lavancomicina pero no por la teicoplanina, a pesar de que se han descrito mutantes resistentes a la teicoplanina
in vivo,tras tratamiento con vancomicina, y en animales de experimentación tratados con teicoplanina
Fenotipo VanA
Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥64 μg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥16 μg/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. El gen de resistencia vanA
se encuentra Localizado en el trasposón Tn1546 de 10,8 Kb, generalmente localizado en un plásmido, aunque, en algunos casos, se ha transferido al cromosoma. En este trasposón están codificadas las siete proteínas que intervienen en la resistencia a los glucopéptidos, a saber: a) VanR y VanS, implicadas en la regulación del gen de resistencia; b) VanA, VanH y VanX, que serían las responsables directas de la resistencia a glucopéptidos; c) VanY y VanZ, proteínas accesorias. La vancomicina actúa uniéndose al dipéptido D-alanil-D-alanina terminal del precusor del péptidoglucano, inhibiendo la síntesis
de la pared celular. La proteína VanA es una ligasa similar a las codificadas cromosómicamente pero que, en lugar de sintetizar el
dipéptido terminal D-Ala-D-Ala, sintetiza el depsipéptido D-Ala-D-lactato con mucha menor afinidad por la vancomicina. La
proteína VanH reduciría el piruvato a D-Lac, necesario para la expresión de la proteína VanA, pero que está generalmente
ausente en el ambiente natural de los enterococos
El gen MecA, es responsable de la resistencia a la meticilina en S. aureus ,(S. aureus resistente a la meticilina) (SARM), no es endógeno y se encuentra integrado al cromosoma bacterianoEste gen se encuentra dentro de un elemento cromosomal móvil heterogéneo conocido como " Staphylococcal cassette chromosome mec " (SSCmec) . Los aislamientos que poseen este elemento genético presentan una disminución en la afinidad a meticilina
ResponderEliminar¿cual es gen que hace que el enterococo se haga resistente a la vancomicina?
ResponderEliminarEn 1986, se aíslan las primeras cepas de Enterococcus resistentes a los glucopéptidos. En la actualidad, este tipo de resistencia se asocia a tres fenotipos bien definidos:
VanA, VanB y VanC . Últimamente, se ha descrito un cuarto tipo, VanD, en una cepa de E. faecium.
Fenotipo VanA
Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina como a la teicoplanina . La resistencia tipo VanA es transferible.
Fenotipo de resistencia VanB
Las cepas portadoras del gen vanB se caracterizan por niveles variables de resistencia a la vancomicina y sensibilidad a la teicoplanina.
Fenotipo de resistencia VanC
El fenotipo VanC se observa en las especies Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens,
intrínsecamente resistentes a la vancomicina, pero sensibles a la teicoplanina.
Fenotipo VanD
Este fenotipo de resistencia se ha descrito en una cepa de E. faecium aislada en los Estados Unidos. Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina y de bajo nivel a la teicoplanina . En este aislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina descritos hasta la actualidad.
RESISTENCIA DEL ENTEROCOCO A LA VANCOMICINA:
ResponderEliminarLa resistencia a la vancomicina fue inicialmente descrita en cepas de la especie de Enterococo faecium aisladas en Francia y Reino Unido.
La epidemiología de los enterococos resistentes a la vancomicina (EVR) parece ser diferente en América y en Europa.
Actualmente, menos de un 5% del total de enterococos aislados en Europa son resistentes a la vancomicina.
La mayoría corresponden a aislamientos procedentes de casos de colonización o infección adquiridos en la comunidad, aunque existen descritos brotes intrahospitalarios. Algunos autores han apoyado la hipótesis de que la aparición de estas cepas estaría relacionada con la utilización del glucopéptido avoparcina en la agricultura y la industria alimentaria, ya que se han aislado en animales de granja. En los Estados Unidos no está autorizada la utilización de este glucopéptido con este fin, y no se han aislado ERV en los animales de granja.
Entre los factores de riesgo de la infección por ERV, hay muchos comunes a la infección por enterococos sensibles a la vancomicina:
a) La administración de antibióticos múltiples o de amplio espectro (vancomicina, cefalosporinas, carbapenemas y antibióticos con acción antianaeróbica, como la clindamicina y el metronidazol), que favorecerían el sobrecrecimiento de los enterococos al actuar sobre el resto de la flora bacteriana.
b) Pacientes con enfermedad de base grave: transplante, cáncer, diabetes mellitus, etc.
c) La hospitalización en una unidad quirúrgica, onco-hematológica o de cuidados intensivos.
d) Una prolongada estancia hospitalaria.
e) La yatrogenia no invasiva, como la inmunosupresión, o invasiva, como la cateterización.
f) La proximidad a pacientes colonizados o infectados por ERV.
GEN MECA
ResponderEliminarCepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina y muchos otros antibióticos son las causas principales de las infecciones nosocomiales en todo el mundo. Resistencia a la meticilina es determinada por el gen mecA, que codifica la baja afinidad penicilina vinculante proteínas PBP 2A. El gen mecA forma parte de un cromosoma estafilococia 21 - 60 kb cassette mec (SCCmec), un elemento genético móvil que también puede contener estructuras genéticas tales como Tn554, pUB110 y pT181 que codifican resistencia a los antibióticos no-β-lactámicos. Se han planteado dos hipótesis para explicar el origen evolutivo de resistente a la meticilina cepas de S. aureus (MRSA).
La hipótesis solo clon, basada en el análisis tempranos de los polimorfismos de longitud de fragmento restricción obtenidos para SARM aislados recogidos en todo el mundo mediante el uso de sondas para la mecA y Tn554, sugiere que mecA entró en la población de S. aureus en una ocasión y dio lugar a la formación de un solo clon MRSA que desde entonces se ha extendido por todo el mundo. La segunda hipótesis, basada en la detección de la mecA en tipos diversos de S. aureus enzimática multilocus electroforesis, propone que las cepas MRSA evolucionaron varias veces por medio de la transferencia horizontal de mecA en cepas distintas filogenéticamente meticilina-susceptibles S. aureus (MSSA) precursor. Mediante el uso de tecnología de microarrays de ADN, mecA se ha detectado en al menos cinco linajes divergentes, lo que implica que la transferencia horizontal de la mecA ha jugado un papel fundamental en la evolución de MRSA. La transferencia de mecA de S. epidermidis a S. aureus recientemente fue presenciada en vivo, sugiriendo que mecA puede transferir más con frecuencia a MSSA.
EL gen mecA
ResponderEliminarEl gen mecA es un gen que se encuentra en bacterianas células. El mecA gen permite una bacteria sea resistente a antibióticos tales como la meticilina , penicilina y otros antibióticos penicilina similares.
El soporte más comúnmente conocido del mecA es la bacteria conocida como MRSA . También se encuentra en Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae cepas resistentes a los antibióticos penicilina similares.
El mecA gen no permite que la estructura de anillo de los antibióticos penicilina como para atacar las enzimas que ayudan a formar la pared celular de la bacteria (transpeptidasas), y por lo tanto las bacterias se le permite replicar de forma normal. El gen codifica la proteína PBP2a ( proteína de unión a penicilina 2A). PBP2a tiene una baja afinidad por los antibióticos beta-lactámicos, tales como la meticilina y penicilina . Esto permite transpeptidasa actividad en presencia de beta-lactámicos, evitando que la inhibición de la síntesis de la pared celular.
FENOTIPOS DE RESISTENCIA A LA
ResponderEliminarVANCOMICINA
Fenotipo VanA
Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥64 μg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥16 μg/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. El gen de resistencia vanA se encuentra localizado en el trasposón Tn 1546 de 10,8 Kb, generalmente localizado en un plásmido, aunque, en algunos casos, se ha
transferido al cromosoma. En este trasposón están codificadas las siete proteínas que intervienen en la resistencia a los glucopéptidos, a saber: a) VanR y VanS, implicadas en la regulación del gen de resistencia; b) VanA, VanH y VanX, que serían las responsables directas de la resistencia a glucopéptidos; c) VanY y VanZ, proteínas accesorias. La expresión de la resistencia a la vancomicina dependerá del desequilibrio entre los precursores con el depsipéptido o el dipéptido terminal. La proteína VanX es una peptidasa que hidrolizaría el dipéptido D-Ala-D-Ala, pero no el D-Ala-D-Lac, evitando así la síntesis de precursores con afinidad normal a la vancomicina. La proteína VanY hidrolizaría los d-Ala-D-Ala terminales ya incorporados a los precursores del péptidoglucano. La proteína VanZ confiere resistencia de bajo nivel a la teicoplanina por un mecanismo desconocido.
Fenotipo Rsistencia VanB
La resistencia VanB se transfiere en algunas cepas por conjugación y se asocia a la movilización de material genético de elevado peso molecular de cromosoma a cromosoma. El análisis de la secuencia de aminoácidos de VanB ha permitido demostrar la elevada homología (65-75%) existente con la ligasa VanA, la deshidrogenasa VanH y la dipeptidasa VanX. Probablemente, las diferencias observadas en la expresión fenotípica y en las sustancias inductoras de la resistencia entre las cepas con fenotipo VanA y VanB sean debidas a variaciones en el sistema regulador, cuya homología es menor (<40%)
Fenotipo Rsistencia Vanc
El gen vanC1,presente en la especie E. gallinarum,y el vanC2 ,presente en las especies E. casseliflavus y E. flavescens (por homología del ADN parece tratarse de la misma especie), determinan la síntesis del depsipéptido terminal D-alanina-D-serina que también tiene menor afinidad por la vancomicina
Fenotipo VanD
Este fenotipo de resistencia se ha descrito en una cepa de E. faecium aislada en los Estados Unidos. Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina (CMI 64 μg/ml) y de bajo nivel a la teicoplanina (CMI 4 μg/ml). En este aislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina descritos hasta la actualidad
FENOTIPOS DE RESISTENCIA A LA VANCOMICINA
ResponderEliminarFenotipo VanA
Las cepas con fenotipo VanA se caracterizan por presentar resistencia inducible de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥ 64 µg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥ 16 µ g/ml). La resistencia tipo VanA es transferible. El gen de resistencia vanA se encuentra localizado en el trasposón Tn1546, de 10,8 Kb, generalmente localizado en un plásmido, aunque, en algunos casos, se ha transferido al cromosoma. En este trasposón están codificadas las siete proteínas que intervienen en la resistencia a los glucopéptidos, a saber: a) VanR y VanS, implicadas en la regulación del gen de resistencia; b) VanA, VanH y VanX, que serían las responsables directas de la resistencia a glucopéptidos; c) VanY y VanZ, proteínas accesorias.
La vancomicina actúa uniéndose al dipéptido D-alanil-D-alanina terminal del precusor del péptidoglucano, inhibiendo la síntesis de la pared celular. La proteína VanA es una ligasa similar a las codificadas cromosómicamente pero que, en lugar de sintetizar el dipéptido terminal D-Ala-D-Ala, sintetiza el depsipéptido D-Ala-D-lactato con mucha menor afinidad por la vancomicina.
La proteína VanH reduciría el piruvato a D-Lac, necesario para la expresión de la proteína VanA, pero que está generalmente ausente en el ambiente natural de los enterococos.
GEN MECA
ResponderEliminarEl gen mecA se encuentra en un elemento genético móvil conocido como el casete cromosómico (Staphylococcal chromosome cassettemec, SCCmec),que se inserta
en un sitio específico del cromosoma bacteriano (attB SCC), cerca del origen de replicación de S. aureus. Esta característica es de gran relevancia porque le permite replicarse en forma temprana y transcribir los genes de resistencia importados.
Dada la complejidad de este mecanismo de resistencia, se ha considerado poco probable que haya surgido por la presión selectiva ejercida por la introducción de los medicamentos β- lactámicos. Aún no está claro el origen del gen mecApero se ha propuesto que pudo haber evolucionado mucho tiempo atrás, en especies de estafilococo libres de penicilinasas que se encontraban bajo presión selectiva por la penicilina, cuando se inició su utilización intensiva como medida profiláctica en veterinaria, luego
de su introducción para uso en humanos.
GEN MECA
ResponderEliminarLa Cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina y muchos otros antibióticos son las causas principales de las infecciones nosocomiales en todo el mundo. Resistencia a la meticilina es determinada por el gen mecA, que codifica la baja afinidad penicilina vinculante proteínas PBP 2A. El gen mecA forma parte de un cromosoma estafilococia 21 - 60 kb cassette mec (SCCmec), un elemento genético móvil que también puede contener estructuras genéticas tales como Tn554, pUB110 y pT181 que codifican resistencia a los antibióticos no-β-lactámicos.
Se han planteado dos hipótesis para explicar el origen evolutivo de resistente a la meticilina cepas de S. aureus (MRSA).
La hipótesis solo clon, basada en el análisis tempranos de los polimorfismos de longitud de fragmento restricción obtenidos para SARM aislados recogidos en todo el mundo mediante el uso de sondas para la mecA y Tn554, sugiere que mecA entró en la población de S. aureus en una ocasión y dio lugar a la formación de un solo clon MRSA que desde entonces se ha extendido por todo el mundo. La segunda hipótesis, basada en la detección de la mecA en tipos diversos de S. aureus enzimática multilocus electroforesis, propone que las cepas MRSA evolucionaron varias veces por medio de la transferencia horizontal de mecA en cepas distintas filogenéticamente meticilina-susceptibles S. aureus (MSSA) precursor. Mediante el uso de tecnología de microarrays de ADN, mecA se ha detectado en al menos cinco linajes divergentes, lo que implica que la transferencia horizontal de la mecA ha jugado un papel fundamental en la evolución de MRSA. La transferencia de mecA de S. epidermidis a S. aureus recientemente fue presenciada en vivo,
RESISTENCIA DEL ENTEROCOCO A LA VANCOMICINA:.
ResponderEliminarLa epidemiología de los enterococos resistentes a la vancomicina (EVR) parece ser diferente en América y en Europa.
Actualmente, menos de un 5% del total de enterococos aislados en Europa son resistentes a la vancomicina.
La mayoría corresponden a aislamientos procedentes de casos de colonización o infección adquiridos en la comunidad, aunque existen descritos brotes intrahospitalarios. Algunos autores han apoyado la hipótesis de que la aparición de estas cepas estaría relacionada con la utilización del glucopéptido avoparcina en la agricultura y la industria alimentaria, ya que se han aislado en animales de granja. En los Estados Unidos no está autorizada la utilización de este glucopéptido con este fin, y no se han aislado ERV en los animales de granja.
Entre los factores de riesgo de la infección por ERV, hay muchos comunes a la infección por enterococos sensibles a la vancomicina:
a) La administración de antibióticos múltiples o de amplio espectro (vancomicina, cefalosporinas, carbapenemas y antibióticos con acción antianaeróbica, como la clindamicina y el metronidazol), que favorecerían el sobrecrecimiento de los enterococos al actuar sobre el resto de la flora bacteriana.
b) Pacientes con enfermedad de base grave: transplante, cáncer, diabetes mellitus, etc.
c) La hospitalización en una unidad quirúrgica, onco-hematológica o de cuidados intensivos.
d) Una prolongada estancia hospitalaria.
e) La yatrogenia no invasiva, como la inmunosupresión, o invasiva, como la cateterización.
f) La proximidad a pacientes colonizados o infectados por ERV.
FENOTIPOS DE RESISTENCIA A LA VANCOMICINA
ResponderEliminarFENOTIPO RESISTENCIA VAN A
Las cepas con fenotipo VanA presenta resistencia de alto nivel tanto a la vancomicina (MIC ≥64 μg/ml) como a la teicoplanina (MIC ≥16 μg/ml). La resistencia tipo VanA es transferible.
FENOTIPO RESISTENCIA VAN B
Se transfiere en algunas cepas por conjugación y se asocia a la movilización de material genético de elevado peso molecular de cromosoma a cromosoma. El análisis de la secuencia de aminoácidos de VanB ha permitido demostrar la elevada homología (65-75%) existente con la ligasa VanA, la deshidrogenasa VanH y la dipeptidasa VanX. Probablemente, las diferencias observadas en la expresión fenotípica y en las sustancias inductoras de la resistencia entre las cepas con fenotipo VanA y VanB sean debidas a variaciones en el sistema regulador, cuya homología es menor (<40%)
FENOTIPO RSISTENCIA VANC
El gen vanC1,presente en la especie E. gallinarum,y el vanC2 ,presente en las especies E. casseliflavus y E. flavescens (por homología del ADN parece tratarse de la misma especie), determinan la síntesis del depsipéptido terminal D-alanina-D-serina que también tiene menor afinidad por la vancomicina
FENOTIPO RESISTENCIA VAN D
Se ha descrito en una cepa de E. faecium . Esta cepa presentaba resistencia constitutiva moderada a la vancomicina (CMI 64 μg/ml) y de bajo nivel a la teicoplanina (CMI 4 μg/ml). En este aislamiento no se detectó ninguno de los tres genes responsables de la resistencia a la vancomicina descritos hasta la actualidad
Que es el gen mecA?
ResponderEliminarEl gen mecA es un gen que se encuentra en células bacterianas. El gen mecA permite que una bacteria se haga resistente a antibióticos , tales como la meticilina , penicilina y otros antibióticos penicilina similares.
El soporte más comúnmente conocida del gen mecA es la bacteria conocida como MRSA . También se encuentra en Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae cepas resistentes a los antibióticos penicilina similares. En Staphylococcus especies, mecA se extiende sobre el SCC mec elemento genético.
El gen mecA no permite la estructura de anillo de los antibióticos penicilina como para atacar las enzimas que ayudan a formar la pared celular de la bacteria (transpeptidases), y por lo tanto las bacterias se le permite replicar de forma normal. El gen codifica la proteína PBP2a ( proteína de unión a penicilina 2A). PBP2a tiene una baja afinidad por los antibióticos beta-lactámicos, tales como la meticilina y penicilina . Esto permite transpeptidasa actividad en presencia de beta-lactámicos, evitando la inhibición de la síntesis de la pared celular.
Gen que hace que hace que el enterococo sea resistente a la vancomicina
La resistencia puede tener varios fenotipos:
• fenotipo vanA, que normalmente tienen codificados los genes para van A pero presenta modificaciones de otros genes. Tiene resistencia tanto a vancomicina como a teicoplanina.
• fenotipo vanB, hay varios genes descritos, con susceptibilidad a teicoplanina y resistencia a vancomicina.
• fenotipos vanC, intrínseco de algunas especies como E. gallinarum y E casseliflavus, también con resistencia a vancomicina pero buena susceptibilidad a teicoplanina. Estas especies pueden colonizar el tracto gastrointestinal pero no tienen importancia clínica (en caso encontrarse E. faecalis o E. faecium el paciente debiera ser aislado por un elevado riesgo de diseminación).
CLASES DE ELISA PARA DIAGNOSTICO DE VIH.
ResponderEliminarELISA DIRECTO.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará
solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA INDIRECTO.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados
deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y
que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA SÁNDWICH “DAS” (DOUBLE ANTIBODY SANDWICH).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de
diagnóstico (antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan
reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el
soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados
a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.